Naukowcy z Lubeki zidentyfikowali „piętę achillesową” wirusa zika

Prof. Rolf Hilgenfeld i jego zespół z Instytutu Biochemii Uniwersytetu w Lubece mają za sobą kilka miesięcy intensywnej pracy. Po rozprzestrzenieniu się wirusa zika w Ameryce Łacińskiej i ustaleniu związku między zakażeniami u kobiet w ciąży a ciężkimi wadami wrodzonymi u płodu rozpoczęli projekt naukowy, nad którym pracowali ponad 6 miesięcy. Pod koniec lipca 2016 r. wyniki ich badań nad strukturą krystaliczną białka niezbędnego do przetrwania wirusa zika opublikowano na łamach „Science” (Lei J. i in., Science 2016, 353 (6298): 503–505).

Pięta achillesowa wirusa zika

„Wiedzieliśmy, że rywalizuje z nami wiele ośrodków, które pracują nad strukturą krystaliczną wirusowej proteazy NS2B-NS3. Kilka grup roboczych deptało nam po piętach, dlatego w ostatnich miesiącach nasze badania były niezwykle intensywne” – opowiada prof. Hilgenfeld. Znajomość trójwymiarowej struktury i fałdowania białka stanowi podstawę do opracowania inhibitorów tej proteazy w leczeniu osób zakażonych. Wirus zika należy do grupy flawiwirusów, podobnie jak wirusy dengi i Zachodniego Nilu. Wszystkie 3 są przenoszone przez komary. Proteazy NS2B-NS3 tych wirusów są niezbędne do ich replikacji. Atakują także białka biorące udział we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. „Można powiedzieć, że to taka pięta achillesowa wirusów” – mówi prof. Hilgenfeld.

W porównaniu do proteazy wirusów dengi lub Zachodniego Nilu proteaza NS2B-NS3 wirusa zika jest nadaktywna i wykazuje wyraźnie wyższe powinowactwo do jej specyficznych substratów. Są one przekształcane 20 razy skuteczniej przez proteazę wirusa zika niż przez proteazy innych wirusów. „Może to oznaczać, że wirus zika rozprzestrzenia się znacznie szybciej niż wirus dengi lub Zachodniego Nilu i może bardziej efektywnie obniżyć wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza. Jednak powyższe stwierdzenia wymagają dalszego potwierdzenia, na razie to tylko spekulacje” – dodaje naukowiec.

Enzymy działają na zasadzie „dopasowania zamka i klucza”. Oznacza to, że specyficzny substrat dokładnie pasuje do tzw. aktywnej kieszeni enzymu, w której zachodzi reakcja katalityczna. Im lepsze dopasowanie trójwymiarowych form enzymu i substratu, tym efektywniej przekształcany jest substrat. Poznanie struktury enzymów powinno zatem wyjaśnić nadaktywność proteazy i pomóc w opracowaniu inhibitora. Taki związek zwiąże centrum aktywne enzymu i zablokuje go dla specyficznego substratu. W ten sposób enzym byłby nieaktywny, a wirus unieszkodliwiony.

Od enzymów do kryształów

Niestety, struktura krystaliczna enzymu jest trudna do zidentyfikowania ze względów technicznych. W tym konkretnym przypadku proteaza NS2B-NS3 zmienia swoją konformację, jeśli jest już związana z substratem lub inhibitorem (postać aktywna). W celu zidentyfikowania struktury aktywnego enzymu badacze potrzebowali białka wiążącego. Z pomocą przyszli im prof. Christian Klein i dr Christoph Nitsche z Uniwersytetu w Heidelbergu, którzy dostarczyli badaczom dipeptyd kwasu borowego. Kwas borowy, mimo że jest znanym inhibitorem proteaz, nie może mieć jednak zastosowania jako lek u ludzi. Związane jest to ze zbyt nieswoistym działaniem kwasu borowego – ogólnie rzecz ujmując: blokuje nawet własne enzymy organizmu.

W celu krystalizacji kompleksu utworzonego z proteazy i inhibitora białko musi najpierw zostać wytworzone i oczyszczone. Następnie bardzo małe ilości roztworu inhibitora białka pipetuje się do mikrostudzienek na 96-dołkowej płytce, w których kryształy mają być hodowane. Ponieważ każde białko ma różne wymagania w odniesieniu do krystalizacji, warunki mogą być modyfikowane indywidualnie dla każdej studzienki na płycie za pomocą robota. „Co najmniej 20 parametrów może mieć wpływ na krystalizację, dlatego warunki muszą być zróżnicowane i regulowane. To trochę jak gra na loterii” – mówi prof. Hilgenfeld. Jeśli zostaną znalezione idealne warunki, pierwszy kryształ pojawi się po upływie 1 lub 2 dni.

10 kwietnia naukowcy udali się z pierwszymi kryształami NS2B-NS3 wirusa zika do laboratorium DESY (Niemiecki Synchrotron Elektronowy) w Hamburgu. Tam dr Jian Lei i Linlin Zhang analizowali materiał za pomocą dyfraktometru rentgenowskiego. To urządzenie mierzy dyfrakcję i natężenie promieniowania rentgenowskiego w krysztale. Rezultatem jest rozkład gęstości elektronów, który można przetłumaczyć, korzystając ze znanej sekwencji aminokwasowej białka, na trójwymiarową strukturę krystaliczną. Za tym wszystkim stoi wysoce zaawansowana matematyka. „Na tym etapie badań nieocenioną pomocą był dr Guido Hansen, ponieważ w tej fazie wyglądało to tak, jakby wszystko było przeciwko nam” – wspomina prof. Hilgenfeld. Powstawanie tzw. kryształów bliźniaczych z dwóch połączonych kryształów sieci znacznie utrudniało pracę.

Szczególna cecha proteazy wirusa zika

Co tak naprawdę stoi za nadaktywnością proteazy wirusa zika? W tzw. kieszeni P2 centrum aktywnego enzymu znajduje się inny aminokwas niż w proteazach wirusa Zachodniego Nilu czy wirusa dengi: asparaginian. „Asparaginian jest ujemnie naładowany i najwyraźniej oddziałuje znacznie bardziej z substratem, który w tym miejscu wykazuje pozytywnie naładowaną resztę aminokwasową. Dlatego wiązanie substratu okazuje się dużo silniejsze”. Wymiana aminokwasów wydaje się być również współodpowiedzialna za nietypowy wzrost skuteczności enzymu. Naukowcom udało się zmniejszyć aktywność proteaz o 50%, przekształcając jedną z reszt asparaginianowych w nienaładowany aminokwas. „Z pewnością istnieje jeszcze wiele czynników, które przyczyniają się do nadaktywności enzymu. Jeszcze ich nie odkryliśmy, wymaga to kolejnych badań”.

Grupa robocza prof. Hilgenfelda będzie kontynuować badanie proteazy i próby opracowania konkretnego inhibitora, który mógłby być stosowany w leczeniu osób zakażonych.

Autor: Dr. Johanna Fraune

Tłumaczenie: Katarzyna Buska

Więcej informacji na temat wirusa zika: http://tropikalne.info/choroby/zika/

Dodaj komentarz

Twój adres email nie zostanie opublikowany. Pola, których wypełnienie jest wymagane, są oznaczone symbolem *